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完整线粒体DNA提取神器—SageHLS




有关线粒体:

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线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器,细胞中制造能量的结构,是细胞进行有氧呼吸的主要场所。线粒体病是遗传缺陷引起线粒体异常,致使ATP合成障碍、能量来源不足等导致的一组异质性病变,又称为线粒体细胞病。常见的线粒体疾病有Leber遗传性视神经病变(LHON)、线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作(MELAS)综合征、肌阵挛性癫痫伴肌阵挛破裂红纤维(MERRF)综合征、母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等,线粒体疾病发病率约为1:5000(约每5000人中1人发病)。不同物种的线粒体基因组(mtDNA)大小有差异,动物线粒体基因组DNA较小,约为15.7~19.5kb,人类的mtDNA大小为16.659Kb。


线粒体DNA测序现状&难点:

mtDNA的突变会产生多种与脑和肌肉组织能量缺陷相关的遗传因素。mtDNA突变的诊断在以下几个方面依然面临着巨大的挑战:
1.总量低:尽管每个哺乳动物细胞有成千上百个mtDNA(每个细胞约300-1000个mtDNA),但是mtDNA基因组非常小(16,659bp,环状),仅占细胞内总DNA含量的0.2%。
2.低拷贝数和分布特异性:对比核基因突变的高拷贝,线粒体蛋白突变通常在每个(杂合或纯合)细胞中只有1-2个拷贝,mtDNA突变仅存在于极小部分的mtDNA分子中。此外,与人类疾病相关的mtDNA突变的分布往往具有组织特异性。
3.同源核假基因干扰mtDNA基因中存在一些核假基因,这些假基因与mtDNA的编码部分具有高度序列同源性。这些假基因的序列读取使mtDNA突变位点的检测更加复杂化。



使用SageHLS平台进行完整mtDNA富集
 

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为了确保低丰度mtDNA突变的检测不受核假基因的干扰,许多研究人员采用传统的氯化铯密度梯度离心法来富集mtDNA,或在NGS二代测序前通过PCR富集特异性的mtDNA序列,该方法虽然是mtDNA富集的金标准,但是整个富集流程所需试剂多,操作繁琐且耗时。Sage Science公司推出的SageHLS全自动大片段DNA回收仪展示了一种新的分离mtDNA的方法(如图1),提供与梯度离心相当的富集得率,且手工操作的时间显著低于密度梯度离心法。
 

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图1:SageHLS一步法提取完整人源mtDNA,取代传统的氯化铯密度梯度离心分离


结果展示:

SageHLS只需通过一个步骤,就可富集得到mtDNA。整个工作流程完全自动化,仅包含1.25小时的提取和片段分离电泳,以及1.5小时的洗脱。提取结果由illumina和ONT两大测序平台进行测序分析后,结果显示(如图2),大部分的二代测序突变结果会在三代测序结果上证实。但是,部分三代测序测得的突变未在二代测序结果中检出。

 

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图2:上部分是ONT MinION测序的结果,下图是illumina MiSeq测序的结果


结果表明:SageHLS可以用来富集完整的人源mtDNA,文中我们采用简单易分离的WBC(白细胞)作为上样样本,使用SageHLS进行mtDNA纯化的过程是完全自动化的,可获得与繁琐耗时的金标准——氯化铯密度梯度离心法同样纯度等级的mtDNA。SageHLS富集得到的mtDNA浓度和纯度完全符合Illumima测序平台对mtDNA样本的需求,同时也能对占比很低的罕见异质性的mtDNA变异位点进行检测。另外,随着单分子平台投入成本的降低(Oxford Nanopore和PacBio),我们的方法对于制备这些平台所需的mtDNA是很有用的,将有助于较大的插入、缺失和重排的检出。


SageHLS功能简介:

SageHLS是一款专用于DNA大片段回收的设备。除了可以提取完整mtDNA(下图),还可以完成靶向大片段DNA的捕获(上图),以及HMW高分子量基因组DNA的回收(50Kb-2Mb)。
 

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环亚生物科技有限公司作为美国Sage Science公司在中国区的独家代理商,自2011年以来将Sage Science的产品线引入国内,一直为国内用户提供专业的全自动核酸片段回收系统的安装测试、应用培训,技术支持与售后维护工作,赢得客户的一致好评与信任。环亚生物科技有限公司将一如既往的支持越来越多的Sage Science用户。




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