INNOSCAN 扫描仪和微阵列被用于抗击传染性疾病

• 内容摘要

病毒、细菌和寄生虫可引起有害疾病，对于这些疾病需要快速有效的检测和治疗工具。感染和致病机制鲜为人知的新传染病是科学研究和临床治疗的巨大挑战。研究病原体与宿主的相互作用、抗原表位和患者免疫反应对于开发新的疾病预防或治疗方法（如疫苗和新药）至关重要。同时，流行病学研究中大型患者队列的众多样品，需要自动化和高通量的样品处理方式。值得注意的是，微阵列和 InnoScan 荧光扫描仪可用于传染病研究的任何步骤，从病原体检测到疫苗验证。使用专门的聚糖阵列，研究人员现在能够解析病毒和细菌感染的精确机制。同样，高密度多肽微阵列是了解免疫反应、解析抗原表位以及设计和验证疫苗的宝贵工具。

图1.聚糖微阵列传染病相关应用案例

• 微阵列基本原理

微阵列是由精确排列在载体表面（通常是显微镜载玻片）已知位置上的生物分子（核酸、蛋白质、多肽、聚糖等）组成的微型矩阵。将患者血清、细胞裂解物或纯化的 DNA 等样品孵育到微阵列上。然后使用 InnoScan 等荧光扫描仪，以更高的灵敏度和更宽的动态范围检测荧光，收集可靠数据。微阵列优于其他技术，因为它们能够同时检测多种相互作用，具有高通量能力，可以使用少量的试剂和样品来测试大量样本。

• 传染性病原体检测和疾病诊断

DNA微阵列可以检测病毒或细菌等病原体。微阵列的多指标检测能力允许在一张载玻片上检测不同的病毒。一个DNA 微阵列可以同时测试 100 种不同的病毒。2015 年，Martinez¹ 等人设计了一种 DNA 微阵列，用于同时检测与儿童胃肠炎有关的各种胃肠道病毒。作者验证了使用 DNA 微阵列检测 10 种不同的病毒，其具有与RT-PCR 相似或更高的灵敏度。研究人员还指出，DNA 微阵列可用于解析一种以上病毒的共感染，有助于了解儿童胃肠炎的病因。同样，由 Khan MJ 等人开发的 SMAvirusChip 是一种 DNA 微阵列，旨在检测由小型哺乳动物和节肢动物传播的病毒²。SMAvirusChip v2微阵列芯片包含 8 个区域，每个区域具有 15,000 个60 碱基寡核苷酸探针，能够检测 416 种病毒，包括登革热 (DENV) 和寨卡病毒。作者使用连续稀释的登革热病毒样品测试了 SMAvirusChip v2 的灵敏度，并将其与经典 RT-PCR 进行比较。结果显示其比RT-PCR 灵敏度低10倍，检测下限为2600 RNA 拷贝每毫升。这些研究共同证明了使用 DNA 微阵列作为患者病毒监测和筛查工具是有效的。最近，Sultankulova 等人，设计了一种用于诊断禽病毒性疾病的寡核苷酸微阵列。他们使用 InnoScan 710 扫描仪检测确定鸟类样本中存在不同禽病毒的荧光信号³。该实验成功地用于一项旨在了解哈萨克斯坦野生鸟类中1型禽流感病毒分子流行病学的大范围研究⁴。该研究包括来自哈萨克斯坦 9 个地区 37 个科鸟类的 860 个泄殖腔拭子样本。该项研究结果有希望解析病毒基因型并建立病毒传播地图。这项工作展示了 DNA 寡核苷酸微阵列作为流行病学研究和病毒监测高通量工具的潜力。

使用 DNA 或蛋白质阵列的细菌血清分型有助于区分引发不同免疫反应的细菌。2010 年 Marimon 等人成功开发了一款抗体微阵列来进行肺炎链球菌血清分型⁵。这种蛋白质血清分型微阵列由针对 83 或 91 肺炎链球菌血清特异性抗体组成。

特定的细菌和抗体结合之后，通过荧光抗体进行检测。InnoScan 710 扫描仪和 Mapix 软件分别用于荧光信号的获取和定量分析。与细菌血清分型的标准方法 Quellung 技术相比，抗体微阵列显示出更好的特异性和更短的实验时间。此外，抗体微阵列的多指标检测能力允许在同一实验中检测交叉反应抗体，而经典方法不具备这一能力。

由于缺乏特定的身体症状或临床标志物，一些疾病难以诊断。例如，上呼吸道疾病可能是由多种病毒引起，但它们具有相同的临床症状。诊断困难会使患者诊断复杂化并影响流行病学监测。为了解决这个问题，俄罗斯圣彼得堡 Smorodintsev 流感研究所的 Marina Plotnikova 开发了一种抗体微阵列，能够区分上呼吸道疾病六种常见病毒：IAV、IBV、RSV、hAdV、hPIV2 和 hPIV3⁶。

该检测是一种基于微阵列的微缩化多重 ELISA 夹心实验，其检测限略低于经典 ELISA。该检测方法的优势在于多指标检测和节省时间。作者声称有可能将同时检测的病原体种类增加到约 50 种。

• 病原体与宿主相互作用研究

为了开发抵抗病原体感染的有效策略，需要研究病原体引起感染的机制。病毒感染通常由病毒蛋白（衣壳蛋白或糖蛋白）和宿主细胞表面受体之间的一种或几种特异性相互作用引发。而细菌的发病机制是由细菌表面糖蛋白介导的，这有时使它们能够逃避人体免疫系统。因此，通过病毒或细菌聚糖结合蛋白 (GBP) 与宿主细胞膜聚糖之间的相互作用，聚糖对于病原体致病能力至关重要。

图2.聚糖微阵列工作流程

通过聚糖微阵列可以深入了解这些相互作用，为药物和疫苗的开发提供线索。

典型的聚糖微阵列工作流程从聚糖微阵列构建开始。使用芯片点样仪将聚糖或凝集素点样在功能化修饰的载玻片表面。聚糖和凝集素分子通过共价结合或非共价键吸附和芯片表面进行固定，这取决于芯片表面的修饰类型。该聚糖阵列用于从样品中捕获聚糖结合分子例如聚糖结合蛋白、病毒、细胞或其他。荧光染料可用于检测聚糖结合蛋白和聚糖之间的相互作用。在孵育步骤之前将聚糖结合蛋白与荧光基团进行偶联，或孵育步骤完成后，在附加步骤中使用针对聚糖结合蛋白的荧光抗体。然后使用微阵列扫描仪检测荧光。 Innopsys InnoScan 是自动化荧光检测的理想工具，能够同时检测两种或三种荧光信号，其Mapix 软件通过图像分析来对荧光信号进行自动化的定量分析（图2）。Scripps研究所 McBride 等人开发了一款含48个微阵列的载玻片芯片来监测甲型流感病毒血凝素亲和力的特异性⁷。该微阵列可同时检测 6 种不同聚糖与 6种聚糖结合蛋白在8种稀释条件下的相互作用。该检测旨在监测禽类病毒是否正在适应人类受体。作者使用 InnoScan 1100 进行实验。他们使用三个荧光通道的同时检测来跟踪芯片上三种不同类型的样品点：他们在微阵列制作过程中使用 Atto488-NHS 染料作为网格标记，使用链霉亲和素-555 染料来检测具有已知特异性且生物素标记的凝集素作为实验对照；用Alexa 647 标记的抗体，来检测甲型流感病毒血凝素的受体结合特异性。由此产生的检测结果与微孔板检测结果相当，但化学试剂和生物试剂的消耗量分别显著减少 1,500 倍和 360 倍（图 3）。凝集素调节病毒，细菌对宿主组织的粘附，介导定植和感染。细菌与宿主组织相互作用的研究对于了解和预防细菌感染至关重要。由于聚糖是复杂的分子，我们需要能够有效研究聚糖与凝集素极其复杂多样相互作用的方法。使用完整细胞的聚糖微阵列是解析几种细菌凝集素与宿主聚糖结构相互作用的有效工具。使用荧光标记的完整细菌而不是纯化的蛋白质，研究人员能够跟踪细菌凝集素与宿主候选聚糖结构的相互作用。

图 3：据评估，一张 48 孔微阵列能评估 8 个稀释条件下的6种聚糖结合蛋白，相当于传统亲和力测定方法的 18 块96 孔板。生物芯片将减少 360 倍的生物试剂消耗（McBride 等人⁷）。

De Olivera 等人⁸使用全细胞聚糖阵列揭示了化脓性链球菌感染率的高低与宿主糖基化结构多样性相关。他们发现M1细菌蛋白对几种末端半乳糖血型抗原结构显示出高亲和力。细菌对宿主细胞的粘附与血型抗原的表达有关，这解释了宿主血型抗原表达与A组链球菌M1T1克隆(GAS)定植之间的关系。

最近，卧龙岗大学和昆士兰大学的研究人员与澳大利亚格里菲斯大学的糖组学研究所合作，发表了如何构建聚糖阵列并研究 GAS 与宿主聚糖结构相互作用的完整方法⁹。他们使用 InnoScan 1100 检测荧光标记的纯化蛋白或荧光标记的完整细菌。

使用完整细菌的聚糖微阵列可以更全面地分析细菌对宿主器官的粘附和定植。

• 病原体感染免疫反应研究

在感染过程中，病原体与宿主的相互作用会触发宿主免疫反应，以控制病原体的定植和感染。先天免疫反应包括促炎分子如细胞因子和趋化因子的产生。这种对病原体的非特异性反应是一种快速且通常有效的控制感染过程。当病原体成功逃避先天免疫反应时，T细胞和B细胞等特化免疫细胞被激活，从而启动适应性免疫反应。因此，炎症是对抗感染因子的首要机制之一。然而，加剧和不受控制的炎症会导致宿主组织损伤。细胞因子和趋化因子分泌分析有助于理解先天免疫反应机制，并有助于深入了解如何控制炎症和避免组织损伤。中国石家庄爱尔眼科医院的研究人员使用抗体微阵列和 InnoScan 300-G（现为 InnoScan 710-G）来研究人类角质细胞在 1 型单纯疱疹病毒 (HSV-1) 感染期间分泌的细胞因子¹⁰。他们能够确定相比未感染角质细胞，18 种炎症相关细胞因子和趋化因子在HSV-1 刺激的角质细胞中表达上调。这些发现为控制 HSV-1 感染和避免先天免疫反应失衡所引起的过度疤痕和组织损伤，提供治疗相关洞见。

Innopsys 成立于1999年。总部位于法国。分部设立于美国的芝加哥。一直致力于生物医学领域相关仪器和软件的自主研发和生产。Innoscan系列扫描仪，采用先进的多共聚焦扫PMT检测器和多激光扫描光路，可以同时进行多通道检测。不仅有效降低了荧光光漂白现象以及信号损失，还可以有效的缩短扫描时间。扫描过程中，可实时自动聚焦。根据芯片片基高度变化，自动调节焦距以获得最佳扫描结果。Innoscan系列不仅是拥有快速、高分辨率和灵活等特点的扫描仪产品系列，更是基因、蛋白、糖类、细胞、组织等多种芯片研究的强大工具。在基因组和蛋白组表达，基因突变，SNP检测，CGH，细菌病毒检测，肿瘤特异性标志筛查，病理组织筛查等方面都有非常广泛的应用。 

环亚生物，生命科学产品全国性代理商，不断把国外顶级的创新产品引入中国。环亚生物具备完善的公司运营、产品管理、营销、售前技术支持和售后维修体系。环亚生物作为Innoscan大中华区代理商，负责Innoscan产品大中华区的营销和售后支持。

• 参考文献

1.Martínez MA, Soto-del Río MDLD, et al. 2015. DNA microarray for detection of gastrointestinal  viruses. J Clin Microbiol53:136–145.   DOI:10.1128/JCM.01317-14

2.Khan MJ, Trabuco AC, et al. 2016. DNA Microarray Platform for Detection and Surveillance of Viruses Transmitted by Small Mammals and Arthropods. PLoS Negl Trop Dis 10(9): e0005017.   DOI:10.1371/journal.pntd.0005017

3.Sultankulova K, Kozhabergenov NS, et al. 2017. New oligonucleotide microarray for rapid diagnosis of avian viral diseases. Virol J 14, 69.   DOI:10.1186/s12985-017-0738-0

4.Orynbayev MB, Fereidouni, S, et al. 2018. Genetic diversity of avian avulavirus 1 (Newcastle disease virus genotypes VIg and VIIb) circulating in wild birds in Kazakhstan. Arch Virol 163, 1949–1954.   DOI:10.1007/s00705-018-3815-9

5.Marimon JM, Monasterio A, et al. 2010. Antibody microarray typing, a novel technique for Streptococcus pneumoniae serotyping. J Microbiol Methods 80(3):274-80.   DOI:10.1016/j.mimet.2010.01.011

6.Plotnikova M, Klotchenko SA, et al. 2019. Antibody microarray immunoassay for screening and differential diagnosis of upper respiratory tract viral pathogens. J Immunol Methods 478:112712.   DOI:10.1016/j.jim.2019.112712

7.McBride R, Paulson JC & De Vries RP. 2016. A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins. J. Vis. Exp. (111), e53847.   DOI:10.3791/53847

8.De Oliveira DMP, Hartley-Tassell L, et al. 2017. Blood Group Antigen Recognition via the Group A Streptococcal M Protein Mediates Host Colonization. mBio 8 (1) e02237-16.   DOI: 10.1128/mBio.02237-16

9.Indraratna A, De Oliveira DMP, et al. 2020. Investigation of Group A Streptococcal Interactions with Host Glycan Structures Using High-Throughput Techniques: Glycan Microarray Analysis Using Recombinant Protein and Whole Cells. In: Proft T., Loh J. (eds) Group A Streptococcus. Methods in Molecular Biology, vol 2136. Humana, New York, NY.   DOI:10.1007/978-1-0716-0467-0_10

10.Han Xian-Kui, Wang Hui-Fang, et al. 2020. P38 Inhibition Prevents Herpes Simplex Virus Type 1 (HSV-1) Infection in Cultured Corneal Keratocytes, Current Eye Research.   DOI:10.1080/02713683.2020.1748658

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