Innopsys荧光扫描仪用于单细胞western blots检测
细胞是生命体最小的组成单位，蛋白质是生命活动的执行者，而细胞内蛋白质丰度的变化对各种生命过程有着至关重要的作用，不仅为生命活动提供物质基础，也是理解细胞功能和发展过程的中心环节。细胞在生长过程中，经过多次分裂增殖，在完成其生命周期的同时也会呈现分子生物学或基因方面的改变，从而产生细胞多样性即细胞异质性，这是一种普遍存在的生物学现象，即使看起来相同的细胞，也可能存在显著的差异。而传统的蛋白质组学是对组织或大量细胞样本进行分析，获得的是均质化后的结果，掩盖了单个细胞的个体差异，而在组织、器官或个体中，细胞具有非常大的异质性，传统的研究方法不能完全衡量细胞的复杂性、多样性以及功能差异。同时基于流式的检测技术，由于很难检测细胞胞内的蛋白水平以及抗体来源受限，使得这一方法有一定的局限性。
随着测序技术的发展，生命科学研究早已进入了单细胞时代，在mRNA水平已经可以很好的从单细胞的维度上探究细胞、组织、器官的发育过程以及与疾病相关的细胞异质性和同质性问题。但由于基因转录水平和蛋白水平相关性并不是很高，也不能完全反映蛋白质的调控作用，所以要更好地理解细胞的调控机制，检测效应分子蛋白质比mRNA更直接有效，对于理解细胞的功能更为重要。近几年，基于单细胞蛋白质组技术的方法快速发展，在很大程度上弥补了单细胞水平蛋白质研究的需求。
本文主要介绍一种单细胞蛋白免疫印迹检测技术(Single cell Westerns Blotting, scWesterns)，是对传统的蛋白免疫印迹(Western blotting)方法的精细化改进，实现了在单细胞层面上高通量的对于单细胞蛋白质组进行免疫印迹检测、定量和分析，与传统的western blots不同，scWesterns方法可以精确量化由外界刺激所引起的单个细胞蛋白质水平的变化。系统组成：scWesterns 检测试剂、全自动电泳分离系统、数据处理软件以及Innopsys芯片扫描仪，检测流程如图(一)所示。scWesterns实验整个过程都是在改造的显微镜载玻片上进行的，载玻片上有通过软光刻技术制作而成的可以固定单个细胞的凝胶槽矩阵，每个微孔都可以看作是一个微型的反应器，对细胞矩阵进行明场光学扫描之后，将凝胶槽转移至微型电泳槽中，进行蛋白凝胶电泳。整个技术可以实现高通量的对单细胞蛋白进行scWesterns检测和分析。
操作流程图一：1.解冻细胞，吹打混匀，离心重悬制备细胞悬液，细胞浓度为 10,000 - 100,000 个细胞/mL，种植细胞，将 1 mL 单细胞悬液从左到右滴加到芯片上，确保整张芯片都被均匀覆盖，细胞在重力的作用下会沉降到光敏胶中，室温静置 5-20 分钟，用明场显微镜观察芯片,确保每个block至少有15%-20%细胞占有率，且很少存在单孔双细胞的状态；2.在仪器电泳槽中加入300uL裂解液进行细胞裂解，根据蛋白大小设置参数运行仪器进行电泳分离和蛋白固定；3.稀释不同种属的一抗（小鼠，山羊，兔）与芯片进行杂交，室温孵育 1-2小时，也可4度过夜，孵育后用wash buffer清洗三次，每次10分钟；稀释二抗，芯片避光与二抗孵育1小时，孵育后用wash buffer清洗三次，每次10分钟，最后用去离子水连续冲洗芯片1分钟；4.使用Innopsys 1100三色荧光扫描仪（红、绿、蓝）进行荧光信号扫描；5-6.使用分析软件进行数据处理和分析。
结果显示：采用scWesterns技术对单细胞进行四个靶蛋白检测，如图二所示，根据不同蛋白分子量的差异以及杂交不同种属的一抗和荧光二抗来区分不同的靶标蛋白，使用Innopsys 1100对红、绿、蓝三种荧光信号进行检测，发现细胞对刺激产生了ERK应答反应，同时检测到了EGFR表皮生长因子受体、以及突变体L858R。
图二：对红，绿，蓝不同荧光标记的目的蛋白（ERK，EGFR,L858R,Tubulin）进行检测，结果如上图所示。
展望：scWesterns技术可以应用于基础研究和医学领域，包括肿瘤细胞：肿瘤的耐药基础研究，恶性肿瘤标志物发现；免疫细胞：机体免疫状态分析以及免疫应答基础研究；干细胞：干细胞分化发育研究，精准控制干细胞分化发育；药物研发：量化细胞对药物制剂的反应。
Innopsys 成立于1999年。总部位于法国，一直致力于生物医学领域相关仪器和软件的自主研发和生产。Innoscan系列扫描仪，采用先进的共聚焦PMT检测器和多激光扫描光路，可以同时进行多通道荧光检测。不仅有效降低了荧光光漂白现象以及信号损失，还可以有效缩短扫描时间。在基因组和蛋白组表达，基因突变，SNP检测，CGH，细菌病毒检测，肿瘤特异性标志筛查，病理组织筛查等方面都有非常广泛的应用。
环亚生物，生命科学产品全国性代理商，具备完善的公司运营、产品管理、营销、售前技术支持和售后维修体系。环亚生物作为Innoscan大中华区代理商，负责Innoscan产品大中华区的营销和售后支持。
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