Blotcycler助力WB实验条件的优化
Western Blotting（WB）蛋白质免疫印迹杂交，是采用印迹技术将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白质转移到膜上，再根据抗原-抗体特异性反应，即一抗/二抗复合物特异性检测复杂样品中某种蛋白的方法（流程如图1）。WB是最常用的蛋白质分析技术之一，广泛应用于蛋白表达水平的检测。
图1：Western blotting实验流程
WB实验过程长，步骤多，结果严重依赖操作者的经验积累和细节把控。为了获得稳定、可靠和可重复的结果，必须优化WB流程的所有步骤。美国Precision Biosystems推出的全自动蛋白质免疫印迹杂交系统Blotcycler，将传统的手工过程自动化处理，极大降低了人为因素的干扰，提高了结果的重复性。在诸多环节中，温度选择同样重要。一抗孵育条件有4℃过夜，室温或37℃下1-2小时（h）几种，其中4℃过夜效果最佳。因此在手工操作流程中，考虑到实际操作的便利和可行性，实验者会采用全程室温，或者一抗4℃过夜孵育其余封闭、二抗孵育和洗膜均在室温下进行。通过对比实验发现，与全程室温或只有一抗4℃孵育相比，多数情况下全程（包括封闭，一抗孵育，二抗孵育和洗膜）4℃，可获取到更好的结果。
洗膜过程在4℃下进行，可以避免特异性抗体-抗原结合的过度解离，同时有效减少非特异性结合，提高结果质量。实验者采用透明细胞肾癌（ccRCC）细胞系的细胞提取物与兔多克隆抗PARP抗体进行WB实验。在完全一致的电泳转膜后，将a膜进行手工封闭孵育和洗膜操作，一抗4℃下过夜孵育，其余步骤均在室温下完成，b膜采用Blotcycler全程4℃下自动化处理，其结果如图2所示：采用手工程序处理的印迹膜，结果检测到多个非特异性条带，见图2a；而Blotcycler全程4℃下自动化处理的印迹膜，仅检测到未切割的PARP蛋白（113kD）以及C端和N端切割的PARP片段（分别为89kD和24kD）的条带，见图2b（数据来自Precision Biosystems）。
图2: a，所有步骤（封闭，孵育，洗膜）均手工操作，一抗孵育4度过夜，其余步骤均室温；b，所有步骤（封闭，孵育，洗膜）均在4度，Blotcycler自动化处理
另外，全程4℃下进行，可以有效提高信噪比和相对灵敏度。实验者采用HeLa细胞的全细胞裂解液和h-IL2进行多重荧光WB平行对比，在完全一致的电泳转膜后，将a、b两张膜分别在室温和4℃下Blotcycler自动化处理。其结果如图3，对两张膜进行荧光强度归一化处理后发现，全程4℃处理的b膜具有更高的信噪比和更好的相对灵敏度，如图3c（数据来自Rockland Immunochemicals, Inc）。
图3: a，所有步骤（封闭，孵育，洗膜）均在室温下进行；b，所有步骤（封闭，孵育，洗膜）均在4度下进行；a和b中，泳道1为marker，泳道2为HeLa细胞的全细胞裂解液，泳道3为重组h-IL2，泳道4为HeLa细胞全细胞裂解液和重组h-IL2的混合样本；c，用MW标准对两张膜进行荧光强度归一化处理后的结果；
从以上数据可以看出，Blotcycler全自动蛋白质免疫印迹杂交系统不仅能避免人为误差，提高结果的重复性，也可以通过优化封闭、洗膜的温度条件，消除非特异条带，提高相对灵敏度，产出高质量的结果
来自美国Precision Biosystems公司的Blotcycler，是一款全自动的蛋白质印迹杂交系统，Western Blot洗液工作站，可整机置于4度环境，自动化完成封闭、孵育、清洗和一抗回收的一系列工作，彻底解放您的双手。专利的流体清洗减少二抗在膜上的附着，降低背景，提高信噪比和灵敏度；自动化的操作流程避免了手工操作带来的误差，保证了批次内和批次间实验的高度重复性；高通量操作和多条件的设定可以辅助您优化Western Blot 实验的条件；开放的实验平台，无需其他额外投入。Blotcycler是从事Western Blot实验的科研工作者最佳选择。
环亚生物，生命科学产品全国性代理商，不断把国外顶级的创新产品引入中国。环亚生物具备完善的公司运营、产品管理、营销、售前技术支持和售后维修体系。环亚生物作为Precision Biosystems产品大中华区独家代理商，负责Blotcycler在大中华区的营销和售后支持。
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